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細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)及基本知識

日期:2025-10-19 19:05
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摘要: 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)及基本知識 一.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞周期的測定 一、原理 細(xì)胞周期指細(xì)胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。 單個細(xì)胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細(xì)胞群體的周期,故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。 測定細(xì)胞周期的方法很多,有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等,這里介紹一種利用BrdU滲入測定細(xì)胞周期的方法。 BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養(yǎng)基后,可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料,...

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)及基本知識

一.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞周期的測定

一、原理

    細(xì)胞周期指細(xì)胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

單個細(xì)胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細(xì)胞群體的周期,故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

測定細(xì)胞周期的方法很多,有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等,這里介紹一種利用BrdU滲入測定細(xì)胞周期的方法。

BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養(yǎng)基后,可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料,經(jīng)過兩個細(xì)胞周期后,細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2,反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期,則染色體中約一半為兩條單體均淺染,另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個周期,則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例,就可算出細(xì)胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品:同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

2、試劑:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液

三、操作步驟

1、細(xì)胞生長至指數(shù)期時,向培養(yǎng)液中加入BrdU,使*終濃度為10μg/ml。

2、44小時加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。

3、48小時后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中,注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

4、常規(guī)染色體制片(見第三部分:染色體技術(shù))。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC 液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液,流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干。

8、鏡檢100個分裂相,計(jì)**、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。

9、計(jì)算: 細(xì)胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時)

附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml   4℃下避光保存。

  (2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,檸檬酸三鈉?2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。

細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

一、原理

   在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時,細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶,能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等,能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑,可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下,能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快,使之迅速通過細(xì)胞*易受損的-5~0℃,細(xì)胞仍能生長,活力受損不大。

目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對細(xì)胞無毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細(xì)胞。

二、操作步驟

(一)凍存

1、消化細(xì)胞(同實(shí)驗(yàn)二),將細(xì)胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘,棄上清液。3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng),計(jì)數(shù),調(diào)整至5×106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中,每管1 ml。

5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口,封口一定要嚴(yán),否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。

6、貼上標(biāo)簽,寫明細(xì)胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。

7、按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。

注意:操作時應(yīng)小心,以免液氮**。液氮定期檢查,隨時補(bǔ)充,**不能揮發(fā)干凈,一般30立升的液氮能用1~1.5月。

(二)復(fù)蘇

1、準(zhǔn)備一個茶缸或1000ml的燒壞,內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。

2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。

3、打開凍存管,將細(xì)胞懸液吸到離心管中。

4、1000rpm離心10分鐘,棄去上清液。

5、沉淀加10ml培養(yǎng)液,吹打均勻,再離心10分鐘,棄上清液。

6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng),**天觀察生長情況。

三、試劑和器材

器材:液氮罐、凍存管(塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機(jī)等

試劑:0.25%胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基(即凍存液)

附:凍存液配制:

培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,使其終濃度達(dá)5—20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存。

細(xì)胞系或細(xì)胞株的建立

一、概念

    1、細(xì)胞系(Cell Line):原代培養(yǎng)舞經(jīng)**傳代成功即成細(xì)胞系,由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系(Lineage of Cells)所組成。

    2、細(xì)胞株(Cell Strain):通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物稱為細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限,稱為有限細(xì)胞株(finitecell strain);如果可以連續(xù)傳代,稱為連續(xù)細(xì)胞株(continuous cell strain)。對于人類腫瘤細(xì)胞,在體外培養(yǎng)半年以上,生長穩(wěn)定,并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系。

   二、建立細(xì)胞系(或株)的要求

   什么樣的體外培養(yǎng)群可被認(rèn)可為己鑒定的細(xì)胞,視具體情況而定,無統(tǒng)一規(guī)定。對于用作原代培養(yǎng)的細(xì)胞只要供體均一,取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定即可,如用做長期培養(yǎng),特別是反復(fù)傳代的細(xì)胞,常需做如下說明:

   1、組織來源:細(xì)胞供體所屬物種,來自人體或者動物;

                個體性別、年齡;取材的器官或組織。

                如系腫瘤組織,應(yīng)說明臨床和病理診斷,以及病歷號等。

   2、細(xì)胞生物學(xué)檢測:

   了解細(xì)胞一般和特殊的生物學(xué)性狀,如細(xì)胞一般形態(tài),特異結(jié)構(gòu),細(xì)胞生長曲線和分裂指數(shù),倍增時間,接種率等。

   如為腫瘤細(xì)胞,為說明來源于原腫瘤組織并保持惡性,須做軟瓊脂培養(yǎng),異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實(shí)驗(yàn)。

   3、培養(yǎng)條件和方法;應(yīng)說明細(xì)胞系(或株)適應(yīng)的生存環(huán)境,即指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及適宜PH值。

   三、若干細(xì)胞建株的要點(diǎn)及基本過程

   (一)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)

   1、取材:材料主要來源于外科手術(shù)或活檢瘤組織,取材時避免用壞死組織,要挑選瘤細(xì)胞集中和活力較好的部位,瘤性轉(zhuǎn)移**結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng),因故不能立即培養(yǎng)者,可凍存。其培養(yǎng)方法及凍存方法同前述正常組織。

   2、成纖維細(xì)胞排除:在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)時能與瘤細(xì)胞同時生長,并常壓過癌細(xì)胞,導(dǎo)致癌細(xì)胞生長受阻以至消失,應(yīng)仔細(xì)排除。

   排除方法常有:機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。

   3、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率

   根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng),建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。一般當(dāng)腫瘤組成或細(xì)胞被原代培養(yǎng)后,要經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長,因此不能局限于一般培養(yǎng)法,須采用一些特殊措施。如:用適宜底物,鼠尾膠原底層及飼細(xì)胞底層等。用細(xì)胞生長因子,根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促細(xì)胞生長因子,如胰島素、氫化可的松,雌**等。也可以考慮動物媒介培養(yǎng)。

  (二)人類**母細(xì)胞建株方法

   l、4ml肝素抗凝血于離心管中,加入2ml RPMI 1640。

   2、混勻后沿管壁緩慢加到預(yù)置有4ml**細(xì)胞分離液的液面上靜置30min。

   3、1500rpm,15min,吸取白細(xì)胞層(**層)于另一離心管中。

   4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細(xì)胞兩次。

  5、將白細(xì)胞接種至1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中,加入10μl環(huán)胞霉素和100μl的EBV(EB病毒)液,混勻。

   6、水浴搖床,40次/分,37℃,3hr。

  7、1500rpm,15min。將細(xì)胞接種至1ml培養(yǎng)基中(內(nèi)含谷氨酰胺1mM/ml)加入10μl環(huán)胞霉素,輕輕混勻,37℃培養(yǎng)。

   8、5天后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化和生長情況,決定是否半量換液。一般半量換液l—2次,并維持環(huán)胞霉素的濃度。

   9、待轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)量明顯上升,并出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊后,可轉(zhuǎn)入25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加1—2ml培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)10—15天,一般每隔3—4天觀察一次,決定是否換液,傳代。

   10、細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后凍存,凍存前應(yīng)進(jìn)行核型分析和存檔。

個別組織細(xì)胞的培養(yǎng)

體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時,所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似,但由于物種、個體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同,各自要求條件有一定差別,所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同,現(xiàn)介紹個別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下:

一、上皮細(xì)胞培養(yǎng)

   上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮組織,故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細(xì)胞,并難以純化,同時上皮細(xì)胞難以在體外長期生存,因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關(guān)鍵。

   體內(nèi)上皮細(xì)胞生長在膠原構(gòu)成的基膜,因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長,另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層(用射線照射后)時,細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度,向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子,均有利于表皮細(xì)胞生長。

   以表皮細(xì)胞為例,用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞,其法如下(黑木凳志夫 1981)

   1、取材:外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊,早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好,取角化層薄者,切成0.5-1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中,室溫,5分鐘。

   3、換入0.25%胰蛋白酶中,4℃過夜。

   4、分離:取出皮塊,用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。

   5、取出表皮,剪成更小的塊后,置0.25%胰酶中,37℃,30—60分鐘。

   6、反復(fù)吹打,制成懸液。

   7、培養(yǎng):用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后,低速離心,吸去上清。

   8、直接加入培養(yǎng)基(Eagle加20%小牛血清)制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)瓶,CO2溫箱培養(yǎng)。

   二、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞,對于研究內(nèi)皮****、腫瘤促血管生長因子(TAF)等有很大價值。

研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法*為簡便,其法如下:

1、產(chǎn)后新鮮臍帶,無菌剪取10—15厘米長一段,如不能立即培養(yǎng),可于12小時內(nèi)保存于4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩扎緊,以防液體返流。

3、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,充滿血管,消化3—10分鐘;注入口用線繩扎,以防液體返流。

4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液,于離心管中,注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后,一并注入離心管中(此步驟可重復(fù))。5、離心去上清,加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)器皿中,置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細(xì)胞長成單層。

三、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

   神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)不易培養(yǎng),只有在適宜情況下,如接種在膠原底層上,或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時,可出現(xiàn)一定程度的分化,長出突起等現(xiàn)象,但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)

組織中比較容易培養(yǎng)的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),不僅能獲得生長的膠質(zhì)細(xì)胞,也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說來,膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定,不易自發(fā)轉(zhuǎn)化,但對外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。

養(yǎng)方法如下:

1、從手術(shù)室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)后,仔細(xì)剝除腦膜、血管和纖維成分,置Hanks液中漂洗一、二次。

2、置于30—50倍體積的Hanks液中,此時腦組織比較柔軟,反復(fù)吹打即制成細(xì)胞懸液。

3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后,細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)快自然下沉,脂肪等雜物易漂浮,可吸除上層、反復(fù)二、三次,即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細(xì)胞成分。

4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液,通過紗網(wǎng)成紗布過濾,計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。

5、接入培養(yǎng)瓶或皿中,置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

該細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過程較長,接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也可能不見細(xì)胞分裂現(xiàn)象,然而一旦生長后即能迅速進(jìn)入旺盛的增殖狀態(tài)。細(xì)胞傳代可以0.25%胰酶消化處理。

四、肌組織培養(yǎng)

各種肌組織均可用于培養(yǎng),以心肌和骨骼肌較實(shí)用。

(-)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)

1、出生1一2天的乳鼠,引頸處死。

2、無菌取大腿肌組織,切成0.3一0.5cm2小塊后,用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。

3、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。

4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。

5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。

  接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化,明膠配置:用Hanks液配成0.01%明膠。

該細(xì)胞接種率約50%,細(xì)胞生長開始呈紡錘形,培養(yǎng)50-52小時后出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止,此時可觀察到橫紋,一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。

(二)心肌細(xì)胞培養(yǎng)

  心肌細(xì)胞是*早的培養(yǎng)材料,Carrel曾長期培養(yǎng)過心肌組織,至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物,*常用的是雞胚心肌。

  心肌比較容易培養(yǎng)和生長,可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法,均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好,原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形,培養(yǎng)成功時,一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。

五、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞屬**細(xì)胞,有多種功能,是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞**和分子**學(xué)的重要對象。巨噬細(xì)胞容易獲得,便于培養(yǎng),并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群,在條件適宜下可生活2-3周,多用做原代培養(yǎng),難以長期生存。

巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系,大多來自小鼠,如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等,均獲惡性,培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能,易于傳代和瓶壁分離,但難以建株。

  培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來源來獲取細(xì)胞,以小鼠腹腔取材法*為實(shí)用,其法如下:

1、實(shí)驗(yàn)前三天,向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml(勿注入腸內(nèi)!),以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3-5秒。

4、置動物于解剖臺,用針頭固定四肢,持鑷撕開腹部皮膚,但勿傷及腹膜壁,把皮膚拉向上下兩側(cè),暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同時用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁,使液體在腹腔內(nèi)流動。

6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè).使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。

7、小心拔出針頭,把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘后,去上清,加10ml Eagle培養(yǎng)基。

9、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細(xì)胞,其中90%為巨噬細(xì)胞。

10、以3×105個貼附細(xì)胞/平方厘米接種。

11、接種數(shù)小時后,除去培養(yǎng)液,可去除其它白細(xì)胞,純化培養(yǎng)細(xì)胞,用Eagle液沖洗1一2次,再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。

六、腎小球分離、移植培養(yǎng)

SD大鼠頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡1~2分鐘,2次,置超凈臺內(nèi),打開腹腔取出腎臟剪碎,置含Hank’s液的無菌培養(yǎng)皿洗滌,置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng),濾過組織Hank’s液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng),濾過,去小組織塊,濾過物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng),輕輕濾過,Hank’s液洗滌1次,收集網(wǎng)上腎小球,鏡下觀察為分離良好的腎小球。腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶,37℃消化20分鐘,加血清終止胰酶反應(yīng),離心除去膠原酶。處理過的腎小球計(jì)數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶,使腎小球大于60個/cm2,加培養(yǎng)基5~10ml(培養(yǎng)基組成:F12—3T3上清1:1;5%馬血清;2.5%胎牛血清;胰島素5μg/ml;25ng/ml氫化可的松;5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲狀腺素0.02ng/ml;D-纈氨酸150ng/ml)腎小球培養(yǎng)8~10天,去除腎小球未生長組分,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時,形態(tài)學(xué)觀察:細(xì)胞生長成單層多角型細(xì)胞,直徑約100μm。

七、裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng)

無菌條件下取出小鼠移植瘤組織,剪成1mm3小塊,用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時,再加等體積0.2%胰酶消化5~8分鐘,在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置(分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成,濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細(xì)胞)來回推動注射器吹打組織以分離單細(xì)胞,終止酶消化方法同上。常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細(xì)胞。

二.細(xì)胞培養(yǎng)的基本內(nèi)容

常用設(shè)備

準(zhǔn)備室的設(shè)備:

單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜(放置未**物品)、儲品柜(放置**過的物品)、包裝臺。

配液室的設(shè)備:

扭力天平和電子天平(稱量藥品)、PH計(jì)(測量培養(yǎng)用液PH值)、磁力攪拌器(配置溶液室攪拌溶液)。

培養(yǎng)室的設(shè)備:

液氮罐、儲品柜(存放雜物)、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱(-80℃)、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(書寫實(shí)驗(yàn)記錄)。必須放在無菌間的設(shè)備:離心機(jī)(收集細(xì)胞)、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱(孵育培養(yǎng)物)、水浴鍋、三氧****機(jī)、4℃冰箱(放置serum和培養(yǎng)用液)。

無菌操作

無菌室的**:

1.定期打掃無菌室:每周打掃一次,先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等,然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5%過氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱(培養(yǎng)箱)**:先用3‰新潔爾滅擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%過氧乙酸,再用紫外燈照射

3.實(shí)驗(yàn)前**:打開紫外燈、三氧**機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘

4.實(shí)驗(yàn)后**:用75%酒精(3‰新潔爾滅)擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。

實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備:

1.肥皂洗手。

2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋

3.用75%酒精棉球擦凈雙手。

無菌操作的演示:  

1.凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面

2.靠近酒精燈火焰操作。

3.器皿使用前必須過火**

4.繼續(xù)使用的器皿(如瓶蓋、滴管)要放在高處,使用時仍要過火。

5.各種操作要靠近酒精燈,動作要輕、準(zhǔn)確,不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。

6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管,防止交叉污染。

器械的清洗和**

玻璃器械洗消:

一、新的玻璃器皿的洗消:

1.自來水刷洗,除去灰塵。

2.烘干、泡鹽酸:烤箱中烘干,然后再浸入5%稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。

3.刷洗、烘干:12小時后立即用自來水沖洗,再用洗滌劑刷洗,自來水沖干凈后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗:用清潔液(重鉻酸鉀120g:濃硫酸200ml:蒸餾水1000ml)浸泡12小時,然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗15次,*后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。

5.烘干、包裝:洗干凈后先烘干,然后用牛皮紙(油光紙)包裝。

6.高壓**:包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子,打開開關(guān)和**閥,當(dāng)蒸氣成直線上升時,關(guān)閉**閥,當(dāng)指針指向15磅時,維持20-30分鐘。

7.高壓**后烘干

二、舊的玻璃器皿的洗消:

1.刷洗、烘干:使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中,泡過來蘇爾溶液(洗滌劑)的器皿要用清水刷洗干凈,然后烘干。

2.泡酸、清洗:烘干后泡入清潔液(酸液),12小時后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗(避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗),再用蒸餾水沖洗3次。

3.烘干、包裝:洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙(油光紙)等包裝,以便于**儲存及防止灰塵和再次被污染。

4.高壓**:包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi),蓋好蓋子,打開開關(guān)和**閥,隨著溫度的上升**閥冒出蒸氣,當(dāng)蒸氣成直線冒出3-5分鐘后,關(guān)閉**閥,氣壓表指數(shù)隨之上升,當(dāng)指針指向15磅時,調(diào)節(jié)電開關(guān)維持20-30分鐘即可。(玻璃培養(yǎng)瓶**前可將膠帽輕輕蓋上)

5.烘干備用:因?yàn)楦邏?*后器皿會被蒸氣打濕,所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。

金屬器械洗消:

  金屬器皿不能泡酸,洗消時可先用洗滌劑刷洗,后用自來水沖干凈,然后用75%酒精擦拭,再用自來水,然后用蒸餾水沖洗,再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓(30分鐘)**,再烘干備用。

橡膠和塑料:

橡膠和制品通常處理方法是:先用洗滌劑洗刷干凈,再分別用自來水和蒸餾水沖干凈,再用烤箱烘干,然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序:

1 . 針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時,或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張,安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上),然后將螺旋稍微擰松一些,放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘**,再烘干備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時應(yīng)該立即將螺旋旋緊。

2. 膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘(用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘),自來水洗凈,烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘,再用自來水,蒸餾水,三蒸水洗凈,烘干。*后裝入鋁盒內(nèi)高壓**,烘干備用。

3. 膠帽,離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時(切記時間不能過長),自來水洗凈,烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘,再用自來水,蒸餾水,三蒸水洗凈,烘干。*后裝入鋁盒內(nèi)高壓**,烘干備用。

4. 膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘,然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)板,凍存管:

6.其他**方法:有的物品既不能干燥**,又不能蒸氣**,可用70%酒精浸泡**。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子,放在超凈臺臺面上,直接暴露在紫外線下**。也可用氧化乙烯**塑料制品,**后需要用2—3周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線**塑料制品效果*好。

為了防止清洗器材已**與末**發(fā)生混淆,可在紙包裝后,用密寫墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水,在包裝紙上作一記號,平時這種墨水不帶痕跡,一經(jīng)高溫,即出現(xiàn)字跡,從而可以判定它們是否**。密寫墨水的配制:氯化鉆(CoC12?6H2o)2g,30%鹽酸10m1,蒸餾水88m1。

注意事項(xiàng):

1.嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程:高壓**時,先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水,以防高壓時燒干,水不能過多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏瑁瑫档透邏?*效果。檢查**閥是否通暢,以防高壓時爆炸。

2.安裝濾膜時注意光面朝上:注意濾膜光滑一面是正面,要朝上,否則起不到過濾的作用。

3.注意人體的防護(hù)和器皿的完全浸泡:A.泡酸時要戴耐酸手套,防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時防止酸液濺到地面,會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有氣泡,以防止泡酸不徹底。

細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與**

器材與試劑:

干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶,青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。

具體步驟:

一. 水的制備:

細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈,不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水

二.PBS的制備與**(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制):

1.溶解定容:將藥品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4?H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有雙蒸水的燒杯中,玻璃棒攪動,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml,搖勻即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶內(nèi)待**:將PBS倒入溶液瓶(大的吊針瓶)內(nèi),蓋上膠帽,并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅**20分鐘。注意高壓**后要用**蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。

三. 胰蛋白酶溶液的配制與**:

  胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān),在pH為8.0、溫度為37℃時,胰酶溶液的作用能力*強(qiáng)。使用胰酶時,應(yīng)把握好濃度、溫度和時間,以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。終止消化時,可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。

1.稱取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液濃度為0.25%,用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水(若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。攪拌混勻,置于4℃內(nèi)過夜。

2.用注射濾器抽濾**:配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器(0.22微米微孔濾膜)抽濾**。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

四.青、鏈霉素溶液的配制于**

1.     所用純凈水(雙蒸水)需要15磅高壓20分鐘**。

2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶,用注射器加4ml**雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶,加5ml**雙蒸水,即每毫升各為20萬單位。

3.使用時溶入培養(yǎng)液中,使青鏈霉素的濃度*終為100單位/ml。1單位=1微克?

五.RPMI1640的制備與**:

1.溶解、調(diào)PH值、定容:先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度*終各為100單位/ml。然后用一個當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。*后定容至1000ml,搖勻。

2.安裝蔡式濾器:安裝時先裝好支架,按規(guī)定放好濾膜,用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待**。

3.抽濾:配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾**。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。

4.分裝:將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。

5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃時兩周有效)。

六.血清的滅火:

細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清,新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后,再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

七.HEPES溶液:

HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。對細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑,能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L,一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。

1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下:

準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g,加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾**,分裝后4℃保存。

注意:因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶,所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制,但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如:稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,過濾**后可完全(20ml)加入1L培養(yǎng)液中,或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。

八.谷氨酰胺:

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì),谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長**甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,4℃下放置1周可分解50%,故應(yīng)單獨(dú)配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時,應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。

一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存,用時加入培養(yǎng)液。配制方法為,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^濾**,分裝小瓶,-20℃保存,使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

九.肝素溶液的配制:

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高,肝素加入全培養(yǎng)液中*終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉,包裝為約為0.56克/瓶,配制時,可將其溶于100ml三蒸水中,定容,過夜,然后過濾**,分裝小瓶,保存溫度為?? ℃ 。使用時,向100ml培養(yǎng)液中加入1ml(**可加入0.9ml)即可。

十. Ⅰ型膠原酶:

0.1%Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和****。注意:因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大,不容易過濾,因此可以用蔡式濾器過濾**。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

十一.明膠溶液:

因?yàn)槊髂z難于過濾,所以配制0.1%明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量0.1克(配成100ml溶液)—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液,明膠也難溶,因此要充分搖勻,過夜放置,然后無菌分裝入50ml小瓶中,4℃保存。

其他培養(yǎng)用液的配制:

20ug/ml內(nèi)皮生長因子,

注意事項(xiàng):

1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張,放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方,并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時因?yàn)檫€要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,為了保證培養(yǎng)液PH值*終為7.2,可在配制時調(diào)PH至7.4。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)(消化法)

具體操作:

一. 傳代前準(zhǔn)備:

1.預(yù)熱培養(yǎng)用液:把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

2.用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

3.正確擺放使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且可減少污染。

4.點(diǎn)燃酒精燈:注意火焰不能太小。

  5.準(zhǔn)備好將要使用的**后的空培養(yǎng)瓶,放入微波爐內(nèi)高火,8分鐘再次**。

6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液:取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。

  7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞:注意取出細(xì)胞時要旋緊瓶蓋,用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面,再在鏡下觀察細(xì)胞。

  8.打開瓶口:將各瓶口一一打開,同時要在酒精燈上燒口**。

二.胰蛋白酶消化;

  1.加入消化液:小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗(沖洗),加入適量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以蓋住細(xì)胞*好,*佳消化溫度是37℃。

  2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞:倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞,若胞質(zhì)回縮,細(xì)胞之間不再連接成片,表明此時細(xì)胞消化適度。

  3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液:棄去胰蛋白酶液,注意更換吸管,加入新鮮的培養(yǎng)液。

三.吹打分散細(xì)胞:

1.吹打制懸:用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。

2.吸細(xì)胞懸液入離心管:將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心:平衡后將離心管放入臺式離心機(jī)中,以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。

   4.棄上清液,加入新培養(yǎng)液:棄去上清液,加入2ml培養(yǎng)液,用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

四.分裝稀釋細(xì)胞:

   1.分裝:將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中,加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

   2.顯微鏡下觀察細(xì)胞:倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量,必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長,傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。*后要做好標(biāo)記。

五.繼續(xù)培養(yǎng):

   用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶,適當(dāng)旋松瓶蓋,放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25%時為一個+,占50%為++,占75%時為+++。

傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng):

  1.嚴(yán)格的無菌操作

   2.適度消化:消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響,消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化,一旦胞質(zhì)回縮,連接變松散,或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

附:EDTA(0.02%乙二胺四乙酸二鈉)消化液配方:

EDTA 0.20g,NaCl 8.00g, KCl 0.20g, KH2PO4 0.02g, 葡萄糖 2.00g,0.5%酚紅4ml,加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓**,使用時調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗,否則再培養(yǎng)時細(xì)胞容易脫壁。

細(xì)胞的復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇的原則-快速融化:必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃,使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶,對細(xì)胞造成損害。

具體操作

一. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:

1.將水浴鍋預(yù)熱至37℃

2.用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

  3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

二.取出凍存管:

  1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。

  2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒,取出所需的細(xì)胞,同時核對管外的編號。

三.迅速解凍:

  1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍,并要不斷的搖動,使管中的液體迅速融化。

  2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內(nèi)。

四.平衡離心:

   用架盤天平平衡后,放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min

五.制備細(xì)胞懸液:

   1.吸棄上清液。

   2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液,吹打制成細(xì)胞懸液。

六.細(xì)胞計(jì)數(shù):

  細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

七.培養(yǎng)細(xì)胞

  將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi),將培養(yǎng)瓶放入37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(或者24-48小時)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng),換液的時間由細(xì)胞情況而定。

初學(xué)者易犯錯誤:

1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。

2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多,導(dǎo)致傳熱不佳,使融化時間延長。

3.離心前忘記平衡,導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多,忘記更換吸頭和吸管,導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

細(xì)胞計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)原理:當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時,通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目,即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

具體操作:

一.準(zhǔn)備工作:    

   取一瓶傳代的細(xì)胞,按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)(消化法)》中的傳代方法繁殖細(xì)胞,待長成單層后以被使用。

二.細(xì)胞懸液制備:

細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后,加入培養(yǎng)液(或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液),吹打制成待測細(xì)胞懸液。

三.細(xì)胞計(jì)數(shù):

1.蓋好蓋玻片:取一套血球計(jì)數(shù)板,將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。

  2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液:用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中,加入5滴臺盼藍(lán)染液(0.4%)或苯胺黑,活細(xì)胞不會被染色,加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。

  3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板:將待測細(xì)胞懸液吹均勻,然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入,要保證蓋片下充滿懸液,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。

  4.統(tǒng)計(jì)四個大格的細(xì)胞數(shù):將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動計(jì)數(shù)板,當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后,數(shù)出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。

  5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度:

(細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù))/ml=          ( 四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)         ×2×104

說明:公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。

公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1:1稀釋。

公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個大格的體積為:

1.0mm(長)×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

四.細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn):

  1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時,要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml,如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;

  2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好,否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

  3.取樣計(jì)數(shù)前,應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液,尤其時多次取樣計(jì)數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻,以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確;

  4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞,若細(xì)胞聚集成團(tuán)時,只按照一個細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時,則只計(jì)上線,不計(jì)下線,只計(jì)右線,不計(jì)左線。

  5. 操作時,注意蓋片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中,否則要重新計(jì)數(shù)。

五.初學(xué)者易犯的錯誤:

  1. 計(jì)數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

  2. 滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

  3. 滴入懸液時的量太多,至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

六.本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制:

4%臺盼藍(lán)母液:稱取4克臺盼藍(lán),加入少量蒸餾水研磨,加雙蒸水至100毫升,用濾紙過濾,4℃保存。

使用液:使用時,用PBS稀釋母液至0.4%即可。

細(xì)胞的凍存

1.先將凍存管放入4℃冰箱,約40min。

2.接著置于-20℃冰箱,約30-60min。

3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。

4.置于液氮罐中長期保存。

5同時做好凍存記錄,在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項(xiàng):

1.使用DMSO前,不需要進(jìn)行高壓**,它本身就有**的作用。高壓**反而會破華它的分子結(jié)構(gòu),以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下,DMSO對人體有害,故在配制時*好戴上手套操作。

2.不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃~-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久,低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi),是“危險溫區(qū)”。

3.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量,及時添加。

滬公網(wǎng)安備 31011702004399號

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