l 背景知識

我們都知道，內**的化學本質是革蘭氏陰性**的脂多糖。它可以激活**細胞的受體TLR4 (Toll like receptor4)和TLR2，從而引發**細胞內一系列的反應，包括產生一系列細胞因子，從而啟動先天**應答（Poltorak, A. et. al., 1998）。

實際上，內**只是一大類能通過TLR受體家族激活先天**系統的供體中的一種。其它的供體還包括**共有的Lipopetide、脂蛋白（Lipoprotein）、鞭毛蛋白（Flagellin）（vison, S. M et. al., 2007）；革蘭氏陰性菌的多聚甘露糖醛酸（Mannuronic acid polymer）、非典型脂多糖（Atypical lipopolysaccharide）、外膜脂蛋白A、膜孔道蛋白（Porin）、外膜蛋白A（Outer membrane protein A）、菌體糖脂質（Glycolipid）、菌毛蛋白A（CsgA）；革蘭氏陽性菌的肽聚糖、磷壁酸；分枝桿菌中特有的三乙酰化脂蛋白（Triacetylated lipoprotein）、二乙酰化脂肽（Diacetylated lipopeptide）、脂阿拉伯甘露糖（Lipoarabinomannan）、結核分支桿菌的結核素（STF）；支原體的二乙酰化脂肽；錐蟲的糖肌醇磷脂（Glycoinositolphospholipids），弓形蟲的Profilin-like protein；**的酵母聚糖；病毒的未甲基化CpG DNA、 ssRNA、 dsRNA，某些病毒的膜蛋白與膜融合蛋白。

這些外源病原性的供體刺激TLR受體家族之后，共有4條信號通路，包括：1依賴于MyD88（骨髓分化基因）信號通路，這是主要通路；2不依賴于MyD88信號通路；3Small GTPase信號通路；4PIP信號通路。四條通路也相互偶聯成網，激活后面的效應途徑，包括有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和NF-κB途徑等等（Oda, K et. al., 2006）。

一旦這些非特異性細胞**途徑激活，作為檢測特異性細胞**的ELISPOT檢測必然會受到干擾。屆時，我們將無法區別哪些斑點是特異性抗原刺激產生的，哪些是非特異性的細胞**反應產生的。所以，增加ELISPOT檢測可信度，提高檢測重復性的一個重要環節就是要嚴格控制好以內**為首的可能干擾ELISPOT檢測的各種TLR供體。

l 應對措施

實際實驗中，*容易出現的TLR供體干擾來源是微生物的污染，包括**、**和酵母。為了盡可能避免內**對實驗結果產生的干擾，重點要做好以下幾個方面：

 1選擇高品質的ELISPOT試劑盒，試劑盒內的成分應該盡量完整。我們推薦達科為/U-Cytech公司的產品。該產品的質量已為國內客戶多年的使用所證實，并且試劑盒內的各種成分非常齊備，除客戶必須自備的Milli Q和PBS之外，客戶不需要自行準備其它試劑，避免了引入各種TLR供體而干擾實驗。

作為對比，BD公司和Diaclone公司的ELISPOT試劑需要客戶自行準備封閉液以及抗體稀釋液，Mabtech公司更是只提供抗體對。特別指出：自行準備的封閉液，封閉之后會直接接觸檢測細胞，引入受污染的微生物或者內**是很普遍的。這就會導致背景變臟，負對照產生額外的斑點，并且實驗孔中特異性的斑點與非特異性的斑點混雜，*終影響整個實驗的重復性與可信度。

ELISPOT檢測中，無菌操作部分需要的各種溶液應該在潔凈的空間內（比如超凈臺內）配制，盡量采用過濾**的方式。以未包被ELISPOT試劑為例，需要保持嚴格潔凈的溶液有：潤濕PVDF膜的酒精、洗滌用超純水或者PBS、包被抗體以及抗體稀釋液、封閉液、培養基、刺激物。

在潔凈的空間內配制可以有效避免灰塵以及其它污染物。采用過濾**可以有效濾**體，如果用高壓**，容易引起生物活性成分失活，而且死亡的菌體反而會釋放出更多的TLR供體成分。

使用無內**的各種耗材、器皿。有些實驗室習慣于使用一次性塑料耗材培養細胞或者做實驗，這些耗材確實使用方便，并且能避免污染。但對于ELISPOT檢測而言，*好選用已經表明不含熱源的品牌。如果使用可重復使用的玻璃器皿，注意嚴格浸泡洗液，嚴格清洗。內**或者某些TLR供體的化學性質非常穩定，只有在濃硫酸/重鉻酸鉀的洗液中或者170°C烘烤4小時才會完全分解。

使用高質量的刺激物。

使用達優®無血清培養基。

*嚴格的無菌操作。

總之，內**以及其它TLR供體是ELISPOT檢測中一大類干擾源。它們并不會導致ELISPOT檢測的完全失敗，故初學者這些干擾源不會太在意。但是要獲得高質量的檢測結果，增加實驗的可信度與重復性，一個進階的實驗者必須考慮這些問題了。