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小鼠血管內皮細胞生長因子D檢測試劑盒之后我又用單抗包被，結果一樣：陰性、空白值好高。

1.包被：將三種單抗混合，1：1000，1:2000,1:4000......1:128000稀釋，做三個平行，4°過夜。

2.**天洗滌4次，每次3min，拍干。5%脫脂乳封閉，37°，2h。

3.洗滌4次，每次3min，拍干。加抗原（為純化好的原核表達蛋白）稀釋濃度為2微克/ml，同時設陰性對照（胎牛血清1：100稀釋），小鼠血管內皮細胞生長因子D檢測試劑盒空白對照（PBS溶液)。37°，1h。

4.洗滌4次，每次3min，拍干。加酶標抗體（1:1000稀釋），37°，1h。

5.洗滌4次，每次3min，拍干。加TMB顯色，每孔100微升。37°，10min。

6.2M硫酸終止，

7.OD450讀數。

小鼠血管內皮細胞生長因子D檢測試劑盒結果，陽性值2.5，陰性對照和空白值很高可達到1.5。之后我又用細胞上清包被，其他和上面一樣，加酶標抗體（1:1000稀釋），封閉用的是1%明膠和2%的BSA，2%的BSA封閉：陰性值1.8，陽性和空白值都在2.0以上。1%明膠封閉：陰性值1.0，陽性和空白值都在2.0以上。

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