96T       僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒

本試劑盒運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體中人Ki-67蛋白(Ki67P)含量。

 檢測范圍

0.313-20ng/mL

 *低檢測限

0.117ng/mL

 實(shí)驗(yàn)原理

將人Ki-67蛋白(Ki67P)抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中的人Ki-67蛋白(Ki67P)與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的人Ki-67蛋白(Ki67P)抗體，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標(biāo)記的親和素，再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人Ki-67蛋白(Ki67P)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(O.D.值)，計(jì)算樣品濃度。

 試劑盒內(nèi)容

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒需自備的設(shè)備及試劑

1.         450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)

2.         單道或多道微量加液器及吸頭

3.         稀釋樣品的EP管

4.         蒸餾水或去離子水

5.         吸水紙

6.         盛放洗液的容器

 試劑盒的儲(chǔ)存及有效期

1.         未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請(qǐng)注意，收到試劑盒后請(qǐng)盡快將TMB 洗滌液，終止液保存于4℃，其他試劑保存于-20℃。

2.         使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。

注意：

試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在**實(shí)驗(yàn)后 1個(gè)月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時(shí)間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒標(biāo)本的采集與保存

1.         血清：

將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時(shí)或 4^oC 過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?span>-20^oC 或-80^oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.         血漿：

用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8^oC 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?span>-20^oC 或-80^oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：

1） 取適量組織塊，于預(yù)冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；

2） 可同時(shí)選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL 預(yù)冷PBS 進(jìn)行充分研磨，該過程需在冰上進(jìn)行（有條件實(shí)驗(yàn)室可選用機(jī)器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融 進(jìn)一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù)2 次）。

3） 將制備好的勻漿液于5000×g 離心5 分鐘，留取上清即可檢測。

4. 細(xì)胞裂解液：

1）貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化，離心收集細(xì)胞（懸浮細(xì)胞可直接離心收集）；

2）將收集到的細(xì)胞用冷PBS 洗3 次；

3）物理方法裂解細(xì)胞（可先超聲破碎細(xì)胞，再反復(fù)凍融）：

i 超聲破碎：取適量PBS 重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂。

ii 反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-20 ^oC 以下冰凍，室溫融解，反復(fù)3 次，使細(xì)胞溶脹破碎。

4）將標(biāo)本于2-8 ^oC 1500×g 離心10 分鐘，收集上清備用。

5. 細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它生物標(biāo)本：

請(qǐng) 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?span>-20^oC 或-80^oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意：

1.         以上標(biāo)本均需密封保存，4^oC保存應(yīng)小于1周，-20^oC不應(yīng)超過1個(gè)月，-80^oC不應(yīng)超過2個(gè)月。

2.         標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。

3.         實(shí)驗(yàn)前紅細(xì)胞裂解液必須用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋。

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒試劑準(zhǔn)備

1.         使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC溶解。

2.         標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為20ng/mL。準(zhǔn)備7個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每個(gè)EP管中加入150μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成不同的梯度， 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3.         濃洗滌液：用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL，進(jìn)行30倍稀釋。

標(biāo)本處理

1.         本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

2.         實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過高，應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

3.         若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性，并注意留存樣本。

4.         使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致  ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

5.         若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素 較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測不出的情況。

6.         某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。

7.         建議使用新鮮樣本，保存時(shí)間過長可能會(huì)存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒操作步驟

1.         加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品*終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

2.         溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

3.         配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用

4.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

5.         加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

6.         溫育：操作同3。

7.         洗滌：操作同5。

8.         顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

9.         終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

10.     測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意：

1.         試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2.         加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加樣或加試劑時(shí)，**個(gè)孔與*后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)*好控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.          溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4.         洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響*后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí) 驗(yàn)過程中。

5.         反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘觀察一次)，如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6.         底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7.         如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。

 實(shí)驗(yàn)流程

1.         實(shí)驗(yàn)前標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣本的準(zhǔn)備；

2.         加樣（標(biāo)準(zhǔn)品及樣本）50μL，37℃孵育30分鐘；

3.         洗板5次，加酶標(biāo)試劑50ul，37℃孵育半小時(shí)；

4.         洗板5次；加入顯色液A，B各50ul,37℃孵育顯色15分鐘

5.         加終止液50μL，立即450nm讀數(shù)。

6.    計(jì)算

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒計(jì)算

各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖(七點(diǎn)圖)，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo))，O.D.值為橫坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo)），繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(*佳方程式應(yīng)依回歸方程計(jì)算的R2值來定，以R2值越趨近于1為好)。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.30，根據(jù)樣品O.D.值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D.值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

 特異性

本試劑盒用于檢測人Ki-67蛋白(Ki67P)，經(jīng)檢測與其它相似物質(zhì)無明顯交叉反應(yīng)。

由于受到技術(shù)及樣本來源的限制，不可能完成對(duì)所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。

 精密度

精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV表示。CV(%) = SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測,每份樣本連續(xù)測定20 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批間差：選取3個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測定，每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測定8次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批內(nèi)差： CV<10%

批間差： CV<12%

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒穩(wěn)定性

經(jīng)測定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。

為減小外部因素對(duì)試劑盒破壞前后檢測值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來進(jìn)行操作可減少人為誤差。